高效毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE)对蛋白质、多肽及其它生物大分子样品的高分离效 率使其在蛋白组学研究中具有很大的应用前景.CE分析碱性蛋白时存在的主要问题是未处理的石英 毛细管壁残留的硅羟基与带正电荷的碱性蛋白质形成不可逆吸附，使谱带展宽，峰托尾，交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的制备及其应用，分离重现性 显著降低[1].解决该问题的方法主要有动态去活法、壁涂层法和极端pH法等，其中以壁涂层法应用 最为普遍.涂层技术可采用物理吸附[2’3]或化学键合两种方式，其中物理吸附技术（如甲基纤维素或者 聚乙烯亚胺等）制柱简单，但稳定性及重现性较差.化学键合涂层（如线性聚丙烯酰胺[4]，交联聚丙烯 酰胺[5~9]等）在毛细管表面形成一层永久性涂层，能够有效地降低电渗流，减少蛋白的吸附，具有较好 的稳定性及重现性.

本文发展了一种制备交联聚丙烯酰胺毛细管柱涂层技术，该涂层可有效地抑制电渗流，具有较好 的分离重现性和稳定性.

1实验部分

1.1试剂与仪器

丙烯酰胺（Amresco)、甲叉基双丙烯酰胺（Bis)( Amresco)、过硫酸按（Amresco)和！"-四

甲基乙二胺（TEMED)(Sigma公司）未进一步处理，直接使用；石英毛细管（50 !mi. d. X 350 !m o.d.)购自河北永年光导纤维厂；溶菌酶和核糖核酸酶A购自Sigma公司；细胞色素C购自Merck公 司；3-(三甲氧基硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（y-MAPS，纯度98%)购自美国Acros公司；甲醇和乙腈为 色谱纯（Fluka公司）.乙酸、丙酮、二甲亚砜（DMSO)、硼酸和磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为 “娃哈哈”纯净水.

实验室自组装毛细管电泳仪，JascoCE-1575紫外检测器（JASCO公司）毛细管(40cm/34cm，总 长/有效）；KH2PO4缓冲液（0. 02 mol/L，pH=4. 0);分离电压 10 kV;虹吸进样 10 cmx15 s; Chrom- perfect 工作站（Micro-Tech. Scientific Inc.).

所有实验均在室温下操作.

1.2生物碱样品（麻黄提取物）的制备

将干燥的麻黄药材（购自大连美罗大药房）用粉碎机粉碎过筛，交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的制备及其应用，准确称取该粉末1.0 g，加入30 mL 甲醇，超声提取30 min,冷却后离心15 min(3 000 r/min)，移取上清液，补充溶剂损失，使其体积达到30 mL.将上述样品溶液用纯水稀释，用0.45 !m微孔滤膜过滤后，将样品储存于4 C冰箱中备用. 1.3毛细管电泳柱的制备

毛细管柱的预处理采用文献[5]方法，稍作改进.先用0.1 mol/LNaOH清洗毛细管内壁1 1用纯 净水冲洗1h，然后用50倍柱体积丙酮清洗.将处理后的毛细管放入气相色谱炉箱内，在140 C通氮 气干燥5 h.将含体积分数为66%的y-MAPS和0. 3%乙酸的乙腈溶液注入到该毛细管中，在50 C水 浴中反应12 h.然后用丙酮冲洗1 h，在140 C通氮气干燥5 1备用.

聚合反应装置采用一个3 mL样品瓶，样品瓶的瓶盖经特殊加工（能耐0.3 MPa的压力），盖上有4 个孔（分别为氦气进口、通气口、毛细管进口和进样针口）.首先将质量分数为3% ~4%的丙烯酰胺和 0. 008% ~0. 03%的甲叉基双丙烯酰胺的混合液加入到样品瓶中，将处理后的毛细管插入到样品瓶中 液面之上，通入氦气除氧约30 min后，向该混合液中先后加入1. 0 !L TEMED和1. 0 !L过硫酸铵（质 量分数为10%)，在氦气流下迅速混匀.将毛细管快速插入到聚合液内，在毛细管末端可以看到聚合 液不断流出.8 min后取出毛细管，用纯净水冲洗，然后在120 C用氮气吹30 min.

1.4电渗流测定

以电中性的二甲亚砜（DMSO)为标记物，测定不同制柱条件下的电渗迁移时间来评价涂层的制备 效果.缓冲溶液为0.002 mol/L硼酸（pH =9.0)，毛细管内径50 !m,长40 cm,检测窗距阳极6. 0 cm. 检测波长214 nm,电压250 v/cm.阳极为含2 !L/mL DMSO的缓冲液，阴极为缓冲液，调整毛细管两

端高度相同.电渗流用电渗淌度(h。）表示，计算方法如下：

弘 eo = #e〇/!(1)

#eo = "/$eo(2)

式中，"为毛细管有效长度，$e。为DMSO的迁移时间，！为电场强度.

1.5 实验方法

碱性蛋白用纯净水溶解，配制成5.0 mg/mL的储备液，然后用水稀释到所需浓度.缓冲溶液为 KH2PO4(pH=4.0, 0. 02 mol/L)，分离电压 250 v/cm，检测波长 214 nm.

麻黄提取物分离条件与碱性蛋白相同，麻黄提取物检测波长210 nm.

2结果与讨论

丙烯酰胺的聚合反应属于自由基链式反应，分子氧具有显著的阻聚作用，氧与自由基反应形成不 活泼的过氧自由基，阻止了链的延长，形成分子量较低的聚合物，不能有效地屏蔽管壁的硅羟基.因 此，去除聚合液中的氧是涂层过程中的关键，采用本文的聚合装置不仅可以完全去除聚合液中溶解的 氧，而且可以防止在聚合过程中氧气的再溶解.另外，丙烯酰胺开始聚合后，聚合液粘度迅速增加，采 用本文的聚合装置可以迅速将聚合液压入预处理的毛细管内，从而使溶液聚合以及与管壁双官能团试 剂的聚合同时进行.

2.1毛细管预处理方法对制柱的影响

对毛细管采用了两种不同预处理方法，对所制备的涂层柱（单体质量分数为4%，交联剂质量分数 为0. 015% )的电渗流进行了比较.参照文献[4 ]方法，硅烷化反应采用体积分数为0. 4%的y-MAPS和 0.3%乙酸的乙腈溶液，于室温下反应12 h，测得电渗流为3.2X10-9 m2 • V-1 • S-1.而采用含体积分 数为66%的y-MAPS和0.3%乙酸的乙腈溶液的硅烷化试剂[5]，在50 C水浴中反应12 h，测得电渗流 为6.67 x10-10m2 • V-1 • S-1.通过比较可以发现，硅烷化反应适合于在较高温度以及高浓度下进行， 因此本实验采用第二种方法进行毛细管预处理.

2.2电渗流的测定

表1为所制备的涂层柱与未涂层柱的电渗流对比结果.可见，交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的制备及其应用，与未涂层柱相比，采用交联聚丙烯 酰胺涂层可以有效地抑制电渗流.另外，交联剂的浓度对结果影响显著，当交联剂浓度较大时，所得 涂层较厚，可以有效地屏蔽管壁的硅羟基.例如，表1中第4组毛细管的电渗流最小（下降到1/300)， 但采用该配比的聚合溶液容易造成毛细管堵塞，因此后续实验采用第二组聚合液配比.

Table 1 EOF from coated capillaries with different compositions

Coating!l2345( Uncoated)

(Acrylamide )( % )4444

![ Bis( cross-linker) )( % )0. 0080. 0l50. 020. 03

l09!eo/)m2 • V-1 .s_”3.390.670. 490. 3397

! The coating time for all coated columns were 8 min. The background electrolyte for EOF measurements was 0. 002 mol/L H3BO3.

2.3分离碱性蛋白

在pH =4.0的0.02 m〇l/L磷酸盐缓冲液中，对3种碱性蛋白质进行了分离，结果如图l所示.3

种蛋白质在l5 min内得到了很好的分离，谱带尖锐 且无拖尾现象.进行多次样品测定后柱效无明显降 低，表明该涂层能够有效地抑制碱性蛋白质在毛细 管壁的吸附（见表2).

Table 2 Reproducibility of migration time and separation efficiency obtained on polyacrylamide-coated capillaries for basic proteins

ColumnReproducibilityC RSD, % ) ( # =5 )

Proteinefficiency (l05plates/m)Run to runDay to dayColumn to column

Cytochrome C3.62l.53.24.5

Lysozyme3.20l. 83. 55. l

Ribonuclease A5.432. l5.26.0

2.4分离生物碱

CE作为一种快速、高效的分离分析技术，已经在黄酮以及生物碱类化合物的分离分析方面得到 广泛应用.由于涂层柱能够有效地降低电渗流，因此可以在普通的磷酸缓冲溶液中分离生物碱类化合 物，而不必采用复杂的缓冲体系^〜^及烦琐的分离优化步骤，可大大简化生物碱类化合物的分离.

采用磷酸缓冲体系，分别在涂层柱以及未涂层柱中对麻黄提取物进行了电泳分离.在未涂层毛细 管中，采用磷酸缓冲体系分离麻黄提取物时，峰变宽严重，其中的4个组分无法有效分离[见 图2(A)].而在聚丙烯酰胺涂层柱中，在完全相同的条件下，4个组分达到了基线分离[见图2(B)]， 且柱效提高l0倍，平均分离柱效为2. 4 X l05plates/m.

Fig. 2 Electropherograms of Ephedrae extract separation on uncoated columnC A) and coated columnC B)

2.5涂层的稳定性

为考察涂层柱的稳定性，取两组涂层柱进行对照实验，一组涂层柱用纯净水冲洗30 min,另一组 依次用0.0l mol/L氢氧化钠水溶液、纯净水分别冲洗l5 min,然后进行相同次数的样品测定，在每天 实验后测定这两组毛细管柱的电渗流，实验完毕后冲入纯净水储存，结果见图3.

实验结果表明，用纯净水冲洗后的涂层柱比较稳定，交联聚丙烯酰胺毛细管电泳涂层柱的制备及其应用，在实验过程中电渗流变化幅度较小.而用氢 氧化钠冲洗后的涂层柱，在实验过程中电渗流迅速增加，在5 d后电渗流接近于未涂层柱.这可能主 要是由于聚丙烯酰胺涂层与毛细管壁通过 Si—O—Si—C键键合的，Si—O—Si—C键在喊 性条件下易于水解，从而使聚丙烯酰胺涂层部分 脱落，露出管壁的硅羟基，导致电渗流迅速增 加.

2.6 结论

本文建立的涂渍交联技术所制备的涂层柱能 够有效地抑制碱性蛋白质在毛细管壁的吸附，具 有良好的稳定性和重现性.将该类涂层柱用于中 药生物碱类样品的电泳分离，平均柱效大于 2. 4 X 105 plates/m.